螢火蟲熒光素酶是一種分子量約為61 kD 的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化Luciferin 氧化成Oxyluciferin，在Luciferin 氧化的過程中，會發(fā)出生物熒光(Bioluminescence)。海腎熒光素酶是一種分子量約為36 kD的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化Coelenterazine 氧化成Coelenteramide，在Coelenterazine 氧化的過程中也會發(fā)出生物熒光。生物熒光可以通過化學(xué)發(fā)光儀(Luminometer)或液閃測定儀進行測定。

　　在 DLR 檢測中，螢火蟲（Firefly）熒光素酶和海腎（Renilla）熒光素酶的活性可在單個樣品中依次檢測。先是先以熒光素(Luciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶(Firefly Luciferase)，后以腸腔素(Coelenterazine)為底物來檢測海腎熒光素酶(Renilla Luciferase)，并在后續(xù)加入海腎熒光素酶底物時，同時加入抑制螢火蟲熒光素酶催化Luciferin發(fā)光的物質(zhì)，使后續(xù)檢測僅僅檢測到海腎熒光素酶的活性，實現(xiàn)雙熒光素酶報告基因檢測。通過熒光素酶和其底物這一生物發(fā)光體系，可以非常靈敏、高效地檢測基因的表達。通常把感興趣基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或5' 啟動子區(qū)克隆在Luciferase 的上游，或把3'-UTR 區(qū)克隆在Luciferase 的下游等，構(gòu)建成報告基因(Reporter Gene)質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染細胞，用適當(dāng)藥物等處理細胞后裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低來判斷藥物處理等對目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。 Renilla Luciferase 相對更多地被用作轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)參，以消除細胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染效率的差異。

　　具有檢測迅速、靈敏度高、檢測范圍廣，無細胞內(nèi)源活性干擾等特點。

訂購信息

試劑盒組分

保存方法

藍冰運輸。-20℃保存，有效期12個月。

【注】：C組分建議預(yù)先使用B組分配制為2 mg/mL儲液，B組分、D組分及配制為儲液的C組分，根據(jù)實驗需求進行小批量分裝。所有檢測工作液建議現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍融。

使用方法
1.細胞裂解
（1）將轉(zhuǎn)入報告基因的細胞中的培養(yǎng)基移除，加PBS 輕輕洗滌兩次（貼壁細胞可直接進行此操作，懸浮細胞要離心收集細胞）。按如下方案加入 1×Lysis Buffer (用無菌水按 4:1 稀             釋 A 組分)， 然后將培養(yǎng)板放在微型震蕩器上室溫震蕩 15 min，充分裂解細胞。

 注：裂解產(chǎn)物可室溫保存 6 h，-70℃可長期存放（裂解產(chǎn)物不能多次反復(fù)凍融）。如果熒光素酶的表達水平比較低，可以嘗試使用更少的裂解液，例如6孔板的每孔用量可以小為  100μL。

（2）將充分裂解后的裂解產(chǎn)物，10000-15000 rpm 離心 3-5 min。離心后將上清液移入新的 EP 管中進行后續(xù)檢測。

（3）細胞裂解后可以立即測定熒光素酶，也可以先凍存，待以后再測定。凍存樣品需融解，并達到室溫后再進行測定。

2. 工作液配制

（1）用B 組分充分溶解C 組分，配制成0.2 mg/mL的螢火蟲熒光素酶檢測液。

注：螢火蟲熒光素酶工作液不能反復(fù)凍融，若單次實驗用量較少，建議按單次使用量分裝成小規(guī)格。

（2）用D組分將E組分稀釋成1× Coelenterazine工作液，稀釋方法為將1 µL E組分加入到49 µL D組分中，此稀釋方法可按比例相應(yīng)擴大。

注：1× Coelenterazine工作液應(yīng)該現(xiàn)用現(xiàn)配。
3. 化學(xué)發(fā)光值檢測

（1）將上述配制好的螢火蟲熒光素檢測液和1× Coelenterazine工作液恢復(fù)至室溫。

（2）按儀器操作說明書開啟化學(xué)發(fā)光儀或具有檢測化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標儀，將測定間隔設(shè)為2 s，測定時間設(shè)為10 s。

（3）每個樣品測定時，取樣品20-100μL(如果樣品量足夠，請加入100μL；如果樣品量不足可以適當(dāng)減少用量，但同批樣品的使用量宜保持一致)。

（4）加入100μL螢火蟲熒光素酶檢測試劑，用槍打勻或用其它適當(dāng)方式混勻后測定RLU(relative light unit)。以報告基因細胞裂解液為空白對照。

注：由于該發(fā)光為瞬時發(fā)光，建議加入螢火蟲熒光素酶檢測試劑后，立即進行發(fā)光值的檢測。

（5）在完成上述測定螢火蟲熒光素酶步驟后，加入 100 μL海腎熒光素酶檢測工作液，用槍打勻或用其它適當(dāng)方式混勻后測定RLU(relative light unit)。

（6）在以海腎熒光素酶為內(nèi)參的情況下，用螢火蟲熒光素酶測定得到的 RLU 值除以海腎熒光素酶測定得到的 RLU 值。根據(jù)得到的比值來比較不同樣品間目的報告基因的激活程度。如果以螢火蟲熒光素酶為內(nèi)參，也可以進行類似計算。

注意事項
1. 為取得理想測定效果，在用單管的化學(xué)發(fā)光儀測定時，樣品和測定試劑混合后到測定前的時間應(yīng)盡量控制一致；使用具有化學(xué)發(fā)光測定功能的多功能熒光酶標儀時，宜先把樣品全部加好，然后統(tǒng)一加入螢火蟲熒光素酶檢測試劑。

2. 由于溫度對酶反應(yīng)有影響，所以測定時樣品和試劑均需達到室溫后再進行測定

3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。